Science Advances | 鄭三多實驗室揭示KCTD介導GPCR脫敏的分子機制

G蛋白偶聯受體(GPCR)被配體激活后，與G蛋白三聚體(α，β和γ亞基)結合，導致G蛋白三聚體解離為Gα亞基和Gβγ亞基，它們分別與下游不同的效應蛋白結合進行信號傳遞。GPCR的信號傳遞是一個級聯放大的過程，為防止過度激活，細胞通過一系列機制及時下調各級信號放大器的效率，該負調控過程即是GPCR的脫敏(desensitization)。其中經典的脫敏機制是GRK/β-arrestin介導的受體內吞。近些年的研究發現KCTD家族蛋白可以通過調控Gβγ亞基介導GPCR的脫敏。

KCTD家族是一類在神經系統中高表達的蛋白，有超過20個成員，且與多種神經系統疾病以及神經系統發育異常相關。KCTD家族具有典型的雙模塊化結構域：N端高度保守的BTB結構域和C端多變的CTD結構域。大部分KCTD家族成員形成同源五聚體結構，通過它們的BTB結構域與Cullin-3和Rbx1蛋白形成特殊的五聚化E3泛素連接酶。然而KCTD8/12/16三個成員失去結合Cullin-3的能力，取而代之的是與GABAB受體結合，介導該受體的快速脫敏。鄭三多等⁽¹⁾在2019年通過結構生物學手段發現KCTD8/12/16的BTB結構域形成開放的五聚體并錨定在GABAB受體的最C端，同時以五聚化的CTD結合5個拷貝的Gβγ蛋白，將其從效應蛋白GIRK鉀離子通道上競爭下來，阻斷其持續激活。有趣的是，雖然與KCTD8/12/16序列差異較大，KCTD2/5/17仍然具備結合Gβγ的能力，并通過E3泛素連接酶活性實現對Gβγ的泛素化降解⁽²⁾。KCTD2/5/17代表了一類新穎的針對Gβγ的脫敏機制，但是目前人們對于KCTD蛋白結合泛素化底物的分子機制仍然不清楚。

2023年7月14日，北京生命科學研究所/清華大學生物醫學交叉研究院鄭三多課題組在Science Advances上在線發表題為"Structural basis for the ubiquitination of G protein βγ subunits by KCTD5/Cullin3 E3 ligase"的研究論文。該研究結合單顆粒冷凍電鏡方法和生化、細胞驗證，闡明了KCTD5招募Cullin3和Gβγ的分子機制，首次獲得了Cullin3/KCTD一類五聚化的特殊E3泛素連接酶復合物的完整模型，提供了對該家族參與泛素化調控機制的基本認識。

果蠅KCTD2/5/17的同源蛋白INC的缺失突變導致果蠅睡眠時間減少將近一半，人源KCTD2和KCTD5可以回補果蠅睡眠表型。研究者發現KCTD2/5/17以及果蠅INC都可以通過CTD結構域結合Gβγ，此外人源KCTD5可以結合果蠅Gβγ的同源蛋白，說明KCTD2/5/17與Gβγ的相互作用界面在進化過程中非常保守。

為克服KCTD5與底物Gβγ之間瞬時、微弱的相互作用，研究者在KCTD5的最C端和Gγ蛋白的N端之間引入一段柔性肽段，以共價結合的方式增加了組分的相對濃度，從而獲得了穩定的復合物，得到分辨率為3.3 ?的復合物結構(圖1A)。結構顯示KCTD5的CTD與Gβγ以5：5的化學計量比形成復合物。通過生化實驗、體內降解實驗以及KCTD5對cAMP積累的調控實驗，研究者證實了KCTD5與Gβγ相互作用界面的合理性，并鑒定到多個對復合物形成關鍵的互作位點。KCTD5與Gβγ的這種結合方式與KCTD12和Gβγ之間完全不同：KCTD5和KCTD12結合在Gβγ亞基不同區域；結合在KCTD5上的5個Gβγ亞基以相對獨立的方式與KCTD5結合，而在KCTD12上的5個Gβγ亞基之間相互作用，協同地與KCTD12結合 (圖1A和1B)。這些特點支持了KCTD5作為E3泛素連接酶的一部分具有靈活的底物招募特點，以及KCTD12與Gβγ之間協同性結合保證可以快速將Gβγ亞基從GIRK離子通道競爭下來。

KCTD5和KCTD12招募Gβγ的特點。A, KCTD5 CTD與Gβγ復合物的冷凍電鏡結構。B, KCTD12 CTD與Gβγ復合物的晶體結構⁽¹⁾。C, KCTD7 BTB與Cullin-3的冷凍電鏡結構密度圖。D, KCTD7的BTB結構域與Cullin-3的結構。

此外研究者解析KCTD7與Cullin 3的復合物結構，解釋為什么有些KCTD蛋白不能結合Cullin-3 (圖1C和1D)。以研究中獲得的KCTD5/Gβγ和KCTD7/Cullin-3結構為參考，研究者最終搭建了包含E2-Ubiquitin、Cullin-3/Rbx1、KCTD5和Gβγ的酶-底物復合物模型(圖2A和2B)，揭示了五聚化的KCTD5/Cullin-3如何將E2偶聯的Ub快速轉移到五個Gβγ亞基的泛素化位點上。此外研究者發現KCTD5通過泛素化降解Gβγ調控D1多巴胺受體下游cAMP的產生(圖2C，2D和2E)。

Cullin-3/KCTD5/Gβγ E3泛素連接酶-底物完整復合物的模型。A和B, 包含Cullin-3、Rbx1、E2、Ub、KCTD5和Gβγ的完整復合物模型的俯視圖(A)和側視圖(B)。E2的催化位點C85與Gβγ的泛素化位點(K23和K29)距離較近。C到E, KCTD5通過泛素化降解Gβγ減少GPCR下游cAMP的產生。

北京生命科學研究所與協和醫學院聯合培養的博士生蔣文通和北京大學聯合培養的博士生王巍為該論文的共同第一作者，鄭三多博士為通訊作者。該研究由科技部、北京市政府和清華大學共同資助，在北京生命科學研究所完成。

[1] Zheng S, Abreu N, Levitz J, Kruse AC* (2019). Structural basis for KCTD-mediated rapid desensitization of GABABB signaling. Nature. 567: (127-131).

[2] M. Brockmann et al., Genetic wiring maps of single-cell protein states reveal an off-switch for GPCR signalling. Nature . 546, 307-311 (2017).